Главная » Нежить » Особливості поживних середовищ для анаеробів мікробіологія
Ротару :В 70 лет выгляжу на 45 благодаря простой методике...
Почему все аптеки молчат? Грибок ногтя боится как огня дешевого...
Алкоголику вместо кодирования подсыпьте незаметно 3-4 капли обычной…
Соломія Вітвіцька: живіт втягнувся за добу, вийшло 22 кг жиру! Їла це ...
Заросли папиллом на шее и в подмышках - признак наличия у вас...

Особливості поживних середовищ для анаеробів мікробіологія

Особливості поживних середовищ для анаеробів мікробіологія

до проведення практичного заняття №8

Дисципліна: «Мікробіологія з основами імунології та технікою мікробіологічних досліджень»

Живильні середовища: призначення, класифікацію, етапи виготовлення, контроль якості виготовлення живильних середовищ. Особливості стерилізації живильних середовищ, умови і терміни зберігання.

- Дотримуватися правил роботи і техніки безпеки з апаратурою.

- Виготовлення поживних середовищ.

- Визначення рН поживного середовища.

І. ПІДГОТОВЧИЙ ЕТАП

ІІ. ВИКОНАННЯ НАВИЧКИ

3. Виготовлений агар розлийте у флакони (не більш ніж на 2/3 об’єми флакону, щоб при стерилізації у автоклаві уникнути намочування пробки), закрийте ватно-марлевою пробкою, а потім паперовим ковпачком, зав’яжіть стрічкою.

4. МПА належить до простих за складом поживних середовищ і його стерилізують у автоклаві при 120 0 (1 атм.) протягом 20 хвилин.

Для правильного фасування.

ІІІ. ЗАКІНЧЕННЯ НАВИЧКИ

Забезпечується інфекційна безпека.

І. ПІДГОТОВЧИЙ ЕТАП

Для попередження розкладання вуглеводу під дією високих температур.

ІІ. ВИКОНАННЯ НАВИЧКИ

ІІІ. ЗАКІНЧЕННЯ НАВИЧКИ

Забезпечується інфекційна безпека.

сироваткового, кров’яного агару»

І. ПІДГОТОВЧИЙ ЕТАП

ІІ. ВИКОНАННЯ НАВИЧКИ

ІІІ. ЗАКІНЧЕННЯ НАВИЧКИ

І. ПІДГОТОВЧИЙ ЕТАП

ІІ. ВИКОНАННЯ НАВИЧКИ

Для подальшого використання.

ІІІ. ЗАКІНЧЕННЯ НАВИЧКИ

Забезпечується інфекційна безпека.

Завдання №3. Запишіть у щоденник середовища для культивування анаеробів.

готують на основі бульйону Хоттінгера, до якого додають шматочки бичачої печінки або м’яса. Стерилізують при 1 атм. протягом 30 хвилин, рН середовища 7,4-7,6. Після посіву матеріалу середовище заливають зверху шаром вазелінової олії товщиною до 1 см.

його готують на основі розтопленого і охолодженого до 60 0 С 1% цукрового (глюкоза) МПА рН 7,4 з додаванням на 100 мл 10 мл стерильного 20% розчину сульфіту натрію і 1 мл 8% розчину хлориду заліза.

готують середовище із свіжого молока. Попередньо його кип’ятять і залишають у прохолодному місці на 1 добу. Знімають верхній шар жиру і процедуру повторюють. Молоко фільтрують і 10% розчином бікарбонату натрію доводять рН до 7,2. Перед стерилізацією до молока додають 5-10% лакмусової настойки та ідентичну кількість 10% розчину бікарбонату натрію, щоб піна молока набула синьо-фіолетового відтінку.

Будова, призначення термостату

Робоча камера має прямокутну форму, її стінки виготовлені з латуні. У верхній частині камери встановлено датчик температури. Для усунення місцевого перегрівання бічні стінки і дно камери обклеєні азбестовим папером. Температурний режим у робочій камері контролюється термометром, який встановлюється через отвір, що розміщений у блоці керування. Всередині камери встановлено металеві полички з отворами для полег­шення циркуляції повітря.

Блок керування призначений для автоматичного регулю­вання та підтримання температури в робочій камері. На панелі блоку керування встановлено тумблер, запобіжники, кнопковий замикач, сигнальну лампу включення в електромережу і одночасно для підсвічування шкали термометра; сигнальну лампу включення нагрівальних елементів термостата, ручки резисторів для встановлення температурного режиму.

АЛГОРИТМ «Підготовка термостата до роботи»:

УВАГА! Чашки Петрі розміщують на поличках і дні робочої камери гіркою оптимально не більше ніж по 5 штук, нещільно, що забезпечує циркуляцію повітря і рівномірне нагріван­ня всіх чашок. Чашки обов'язково ставлять догори дном. Це забезпечує добру аерацію чашок і запобігає потраплянню конденсаційної води з кришки чашки на посів, яка перешкоджає утворенню ізольованих колоній.

Методи культивування облігатних анаеробів

Залежно від способу видалення кисню розрізняють такі методи їх культивування: фізичні, хімічний і біологічний.

Ф ізичні методи ґрунтуються на механічному видаленні або запобіганні проникненню кисню в поживне середовище або в навколишній простір.

Метод Віньяля—Вейона. У пробірку з розплавленим і охолодженим до 43-45°С напіврідким агаром піпеткою вносять досліджуваний матеріал і добре перемішують. Потім агаром з посівом заповнюють стерильну пастерівську піпетку, яка з одного кінця щільно закрита ватною пробкою. Піпетку запов­нюють до кінця, не допускаючи попадання повітря. Нижній кінець піпетки запаюють у полум'ї спиртівки. Засіяні піпетки вміщують у велику пробірку, на дні якої накладена вата, або загортають у щільний папір і поміщають у термостат. Колонії мікроорганізмів добре видно через скло. Вони мають вигляд двояковипуклої лінзи або жмутика вати. Після культивування роблять надріз піпетки терпугом поряд з колонією, ламають пі­петку, зафламбованою петлею відбирають колонію і пересівають її на стерильне поживне середовище для виділення чистої культури анаеробів.

Культивування у високому стовпчику агару. Щільне серед­овище (наприклад, Вільсона-Блера) наливають у велику хімічну пробірку на 2/3 її висоти. Перед посівом його розплавляють і охолоджують до температури 43-45°С. Швидко роблять посів піпеткою, добре перемішують (прокручують пробірку між долонями рук) і ставлять у банку з холодною водою, щоб не відбулося насичення середовища киснем з повітря. Після ущільнення агару пробірки поміщають у термостат для культивування мікроорганізмів. Анаероби ростуть у нижній частині середовища.

Під час культивування облігатних анаеробів у рідких поживних середовищах спочатку проводять їх регенерацію (кип’ятять середовища на водяній бані 20-30 хв. для видален­ня повітря). Потім середовище різко охолоджують і роблять посів (регенеровані середовища мають бути використані протягом 20-30 хв., в іншому разі їх повторно регенерують). Після посіву середовище заливають стерильним вазеліновим маслом шаром 1-1,5 см. До таких поживних середовищ належить середови­ще Кітта-Тароцці. На ньому анаероби утворюють дифузний ріст, унаслідок чого воно мутніє.

Хімічний метод ґрунтується на видаленні кисню хімічними речовинами. Для поглинання кисню з навколишнього простору використовують метод Арістовського. На дно ексикатора поміщають хімічні речовини, які легко поглинають кисень із повітря (натрію гідросульфіт або багатоатомний фенол - піргалол). У розширену частину ексикатора поміщають чашки Петрі з посівами і щільно закривають кришкою. Ексикатор ставлять в термостат.

Завдання №5. Проведіть дезінфекцію робочого місця, рук.

Завдання №6. Оформіть щоденник. Зробіть висновки.

Характеристика поживних середовищ. Поняття про культуральні і біохімічні властивості мікроорганізмів. Бактеріологічний метод дослідження, значення для діагностики.

Для культивування мікроорганізмів у лабораторії використо­вують поживні середовища. Вони мають забезпечувати оптимальні умови для росту і розвитку мікроорганізмів і відповідати таким ви­могам:

1) бути поживними, тобто містити речовини, які необхідні для побудови клітини і є джерелом енергії;

2) мати оптимальну реакцію середовища, яка визначається по­казником концентрації іонів водню — рН; вона впливає на ак­тивність ферментів і проникність клітинної оболонки. Біль­шість патогенних мікроорганізмів потребують слабколужної реакції середовища (рН 7,2—7,4);

3) бути буферними, тобто містити речовини, які нейтралізують надлишок іонів водню або гідроксид-іонів, що утворюються внаслідок метаболізму. Буферність має певні межі, тому коли в середовищі утворюється багато кислоти внаслідок метабо­лізму вуглеводів, змінюється колір індикатора, що міститься в середовищі. За зміною кольору індикатора визначають фер­ментативну активність мікроорганізмів;

4) бути ізотонічними для мікробної клітини, тобто мати такий осмотичний тиск, як і всередині клітини. Для більшості мі­кробів він відповідає 0,5 % розчину натрію хлориду;

5) мати певний окисно-відновний потенціал, який вказує на на­сиченість середовища киснем. Для аеробів забезпечують аера­цію середовища, для анаеробів, навпаки, видаляють кисень із поживних середовищ;

6) щільні середовища повинні мати оптимальну консистенцію, тобто містити певну кількість вологи;

7) бути стерильними, адже стороння мікрофлора пригнічує ріст досліджуваної культури, а також змінює склад і властивості поживного середовища, перешкоджає визначенню властивос­тей основної культури;

8) бути уніфікованими за певними інгредієнтами. Так, всі по­живні середовища повинні містити: сумарного азоту аміно­груп амінокислот і низькомолекулярних поліпептидів — 0,8—1,2 г/л, загального азоту — 2,5—3,0 г/л, хлоридів, у перерахунку на натрію хлорид, — 0,5 %, пептону — 1 % ;

9) бути прозорими (за можливості). На прозорих середовищах зруч­ніше визначати культуральні властивості, швидше можна помі­тити забруднення основної культури сторонньою мікрофлорою.

Вибір поживного середовища для культивування залежить від властивостей мікробів (типу живлення, дихання) і мети культиву­вання. У мікробіологічній практиці використовують велику кіль­кість поживних середовищ. Класифікують їх за походженням сиро­вини, консистенцією, складом і призначенням.

За походженням сировини поживні середовища бувають нату­ральні і синтетичні.

Натуральні середовища виготовляють зазвичай із сировини тваринного походження: м'яса (головним чином із яловичини), яєць, молока, риби; а також рослинного: соєвих бобів, гороху, рису, ячменю, моркви, картоплі, буряку.

Синтетичні середовища готують із хімічно чистих органічних і неорганічних сполук відповідно до встановленого дозування.

За консистенцією (щільністю) розрізняють середовища рідкі, напіврідкі і щільні. Напіврідкі і щільні середовища виготовляють із рідких, додаючи до них агар-агар або желатин. Агар-агар — це тверда волокниста речовина, яку виробляють із морських червоних водоростей. За хімічним складом це полісахарид. Для мікробів він не є поживною речовиною.

Желатин (від лат. двІаШв — замерзлий, застиглий) — продукт денатурації колагену — білка сполучної тканини. Його виварюють із кісток, хрящів, сухожилків тварин. Деякі мікроорганізми вико­ристовують його як поживну речовину, в цьому разі желатин розрі­джується. На цьому поживному середовищі вивчають протеолітичні властивості мікробів.

Інколи для ущільнення поживних середовищ використовують си­лікагель. У щільних середовищах він міститься у кількості 1,5 %.

У 1989 році у Київському медичному інституті імені О.О. Бого­мольця розроблено метод виготовлення щільних поживних серед­овищ на синтетичній полімерній основі, яка є модифікованим полі-акриламідним гелем — пластагаром. Він є повноцінним замінником дефіцитного агару.

Щільні поживні середовища готують також із сироватки крові, що зсілася, яєчної маси, яка в разі підвищення температури зсіда­ється, із картоплі, моркви, буряку.

За складом середовища поділяють на прості (універсальні) і складні. До простих відносять: м'ясопептонний бульйон (МПБ), м'ясопептонний агар (МПА), поживний желатин, пептонну воду.

Складні поживні середовища готують із простих, додаючи до них кров, сироватку крові тварин (великої рогатої худоби, коней) або лю­дей, асцитичну рідину, вуглеводи, жовток курячого яйця, молоко й інші речовини, які необхідні для розвитку мікроорганізмів.

За призначенням розрізняють поживні середовища: осно­вні, спеціальні, елективні, селективні, середовища накопичення, диференціально-діагностичні, консервуючі.

Основні (загального вжитку) середовища використовують для культивування більшості патогенних мікроорганізмів. Це прості поживні середовища: МПБ, МПА, поживний желатин, пептонна вода.

Спеціальні середовища використовують для культивування певних видів мікроорганізмів, які на інших середовищах ростуть погано або взагалі не ростуть. Лужна пептонна вода (рН 7,1—9,3) використовується для культивування холерного вібріона, жовтково-сольовий агар (ЖСА) — для стафілокока.

Елективні середовища застосовують для виділення і накопи­чення мікроорганізмів. Елективним середовищем для сальмонел є середовище, що містить 10—20 % жовчі.

Селективні (від лат. веІвсНо — вибір) середовища сприяють рос­ту одних видів мікробів і пригнічують ріст інших. Щоб середовище було селективним, до нього додають солі, антибіотики, барвники або змінюють рН. їх використовують у тому випадку, коли патоло­гічний матеріал містить різноманітну сторонню мікрофлору. Серед­овище Ендо містить барвник, який пригнічує ріст грампозитивних мікроорганізмів, але стимулює ріст грамнегативних.

Середовища накопичення — це рідкі селективні середовища. Так, середовищем накопичення для збудника дифтерії є МПБ із до­даванням сироватки крові й калію телуриту.

Диференціально-діагностичні середовища використовують для того, щоб відрізнити один вид мікробів від інших.

Консервуючі середовища призначені для первинного посіву і транспортування патологічного матеріалу. В них створюються умо­ви, за яких патогенні мікроби зберігаються, а ріст сапрофітів при­гнічується.

У мікробіологічній практиці широко використовують сухі по-середовища (спеціальні, прості, селективні, диференціально-діагностичні тощо). Перевага сухих поживних середовищ полягає в тому, що їх можна легко і швидко приготувати; вони мають по­стійний склад, через це можна порівнювати результати досліджень, отримані в різних лабораторіях (стандартні умови культивування); їх зручно транспортувати. Крім того, ці середовища економічні. Як джерело вуглецю і азоту в них використовують гідролізати кільки, казеїну, фібрину і навіть гідролізат білків сарцин.

Поняття про культуральні властивості мікроорганізмів. Бактеріологічний метод дослідження, значення його для діагностики

Під час культивування на щільних поживних середовищах бак­терії утворюють колонії. У різних видів мікробів колонії різняться за розміром, формою, формою краю, прозорістю, рельєфом, поверх­нею, кольором, консистенцією. В рідких поживних середовищах мікроби можуть утворювати помутніння середовища, осад, плівку. Ознаки росту бактерій на поживних середовищах зумовлюють їхні культуральні властивості, які враховують під час ідентифікації культури.

Бактеріологічний (культуральний) метод дослідження полягає в тому, що патологічний матеріал висівають на поживні середовища, виділяють чисту культуру збудника, а потім його ідентифікують.

Бактеріологічне дослідження проводять для діагностики інфек­ційних хвороб, виявлення мікроорганізмів у навколишньому серед­овищі, визначення виду і варіанта мікробів, а також для виділення продуктів життєдіяльності мікроорганізмів: токсинів, ферментів, антибіотиків тощо.

Умови культивування мікроорганізмів. Для успішного культи­вування мікроорганізмів у лабораторних чи промислових умовах необхідно правильно підібрати поживні середовища, правильно виконати посів і створити належні умови для культивування: за­безпечити оптимальну температуру, відсутність світла, вологість, аерацію або відсутність повітря (кисню), витримати певний термін культивування.

Оптимальну температуру створюють у термостаті.

Для більшості мікроорганізмів, у тому числі і патогенних, світло не потрібно, тому їх культивують у темряві (термостат має непрозорі стінки). Але утворення пігменту відбувається при розсіяному світлі, через те культуру, яка виросла в термостаті, витримують 2—3 доби при розсіяному світлі, не допускаючи попадання на неї прямих со­нячних променів.

Вологість — неодмінна умова розвитку мікроорганізмів, тому їх краще висівати на свіжовиготовлені середовища.

Аерація необхідна для культивування облігатних аеробів і фа­культативних анаеробів. У пробірки кисень разом із повітрям про­никає через ватно-марлеві пробки, в чашки Петрі — через щілину між кришкою і дном чашки.

Облігатні анаероби культивують в умовах повної відсутності кис­ню в поживних середовищах і навколишньому просторі.

Термін культивування для різних мікробів різний. Більшість патогенних мікробів культивують протягом 18—24 год, але деякі ростуть повільніше: бордетели — 3—4 доби, спірохети — 7—12 діб, мікобактерії туберкульозу — до 3 міс.

Внутрішньоклітинних паразитів (віруси, хламідії, рикетсії) культивують у культурі тканин, культурі клітин, у курячому ембрі­оні, в організмі чутливих тварин. Термін їх культивування різний. У хламідій цикл розвитку триває 36—72 год, у вірусів — 48—96 год, у рикетсій — 7 діб.

Данілейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології: підручник. — К.: Медицина, 2009. — 391 с.

Дикий И.Л. Микробиология. Руководство к лабораторным исследованиям: Учеб. пособие. — К.: Видавничий дім“Професіонал”, 2004. — 583 с.

Практикум з мікробіології: навч. посібник. — 2-е вид., переробл. та доповн. / О.В. Кононов. — К.: Медицина, 2011. — 184 с.

Практичнамікробіологія: Посібник /С.І. Климнюк, І.О. Ситник, М.С. Творко, В.П. Широбоков— Т.: Укрмедкнига, 2004. — 438 с.

Люта В.А., Кононов О.В. Мікробіологія:підручник. — К.: Медицина, 2008. — 454 с.

Люта В.А., Кононов О.В. Практикум з мікробіології. — К.: Медицина, 2008. — 183 с.

Ситник І.О., Климко С.І., Творко М.С., Мікробіологія, вірусологія, імунологія: підручник. — Тернопіль: Укрмедкнига, 1998. — 392 с.

Воробьев А.Аи др. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. — М.: Медицинское информационное агенство, 2008. — 702 с.

Воробьев А.А., Быкова А.С. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. — М.: Медицинское информационное агенство, 2003, 232 с.

Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія з вірусологією та імунологією. — К.: Вища школа, 1992. — 431 с.

Федорович У.М.Спеціальна мікробіологія. — ч. 1. — Л.: Євросвіт, 1998. — 227 с.

Федорович У.М. Спеціальна мікробіологія. — ч. 2. — Л.: Ахілл, 2001. — 475 с.

Федорович У.М. Спеціальна мікробіологія. — ч. 3. — Л.: Сплайн, 2008. — 191 с.

Ротару :В 70 лет выгляжу на 45 благодаря простой методике...
Почему все аптеки молчат? Грибок ногтя боится как огня дешевого...
Алкоголику вместо кодирования подсыпьте незаметно 3-4 капли обычной…
Соломія Вітвіцька: живіт втягнувся за добу, вийшло 22 кг жиру! Їла це ...
Заросли папиллом на шее и в подмышках - признак наличия у вас...